生物醫藥:最新的、最給力的分子間相互作用分析技術平臺_--MST微量熱泳動儀

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樓主 2019-11-23 14:27:44
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浙江納德科學儀器有限公司,作為全國知名的科學儀器代理和生產商,不僅僅代理了瑞士Roche 、瑞士Tecan、瑞士Metrohm、德國Eppendorf、德國Sartorius、英國Sphere Fludics、法國Froiloba、美國NuAire、美國MVE、日本Hitachi、日本Tomy等總代或省代生命科學儀器 ,還與瑞士Belimed、西班牙Tesltar等品牌保持良好發展的合作關系,近兩年攜手德國NanoTemper在浙江地區開展生物、制藥等部門的行業布局,積極為廣大的研究者提供快速、準確、有預見性的工具。

? ? ? ? 不久,浙江納德科儀還將打算與美國GE純化部門在工業客戶口子合作,提供蛋白純化儀器和耗材服務,解決從分子生物學、細胞篩選、細胞培養、蛋白純化、蛋白制劑、存儲與安全等一個體系的解決方案。



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? ? ? ? ? ? Made ?in Germany

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全球已有600家高校,科研機構和企業使用Monolith系列微量熱泳動儀.進行生物分子相互作用研究,發表文獻超過2000篇。


德國NanoTemper分子間相互作用測量儀MST------最新的分子間相互作用分析技術平臺

? ? ? NT.115

通用款,適合于結合位點測試

? ? NT.115Pico

? ? ? ? ? ? ? ? ?高靈敏性

NT.LabelFree

? ? ? ? ? ? ? ? 無染料標記

? ? ? ? ? NT.Automated

? ? ? ? ? ? ? ? ? ?高通量(可以整合自動化移液工作站)



快速、無需固定、低樣品量、天然溶液、高靈敏度


技術優勢:

☆ 快速:在10 分鐘之內測量解離常數

☆ 高靈敏范圍:從離子和片段結合到復合物間作用

☆ 天然的環境條件:直接在血清和裂解液中測量

☆ 樣品使用量低:nM 的濃度下只需<4ul 樣品量

☆ 溶液測量:不需要固定到固相表面

☆ 動力學范圍:pM 和mM 的解離常數

☆ 極低消耗費、無維護費、簡單易操作




工作原理:

微量熱泳(MST)是一種分析生物分子的技術。微尺度熱泳是粒子在微觀的溫度梯度中的定向運動。生物分子結構/構象的變化引起的水化層的變化導致的沿溫度梯度運動的相對變化可以用來確定親和力。甚至像蛋白質磷酸化或小分子結合到靶標上都可以被監測。MST 也允許直接在溶液中測量分子間相互作用,而不需要一個固定的表面(無需固定)。



MST 是由總部設在慕尼黑的德國高科技公司NanoTemper 技術有限公司發展出來的。微尺度熱泳(MST)是一種新的方法,可以定量分析溶液中微升的分子間的相互作用。 MST 是基于熱泳效應,即沿溫度梯度定向的分子運動。 一個空間的溫度差ΔT 導致分子濃度在溫度升高的地區的變化,用Soret 系數ST 定義為:C 熱/ C 冷= EXP(-STΔT)。


熱泳取決于分子和溶劑之間的界面。在恒定的緩沖條件下,熱泳反映出分子大小,電荷和溶劑化熵。 一個熒光標記分子A 的熱泳由于大小、電荷和溶劑化熵的差異通常顯著不同于分子和靶標形成的復合物AT。這種分子的熱泳的區別可以用來量化在一定緩沖條件下,梯度滴定實驗的結合常數。


MST 技術介紹

測量熒光標記分子的熱泳運動是通過監測熒光毛細管內分布F。微觀的溫度梯度產生的紅外激光,這是集中到毛細管強烈被水吸收。 水溶液在激光光斑的溫度升高ΔT= 5 K.之前的紅外激光是在同質化的熒光分布F 是毛細管內觀察到的冷切換。 當紅外激光開關,兩方面的影響,其時間尺度分離,有利于新的熒光分布F 熱。 熱弛豫時間快和誘導熒光染料,由于當地環境的依賴反應溫度跳躍約束力的依賴下降。 在較慢的擴散時間尺度(10 秒),分子運動從局部加熱區域外的低溫地區。 當地的分子濃度降低,直到達到一個穩態分布在激烈的地區。

雖然質量擴散D 的決定消耗的動力學,S T 確定的穩態濃度比例下溫度上升chot/ccold=exp(-ST ΔT) ≈ 1-ST ΔT。

歸一化熒光Fnorm = F 熱/ F 冷主要是這個濃度比,除了溫度跳躍?F /?T。 的線性近似,我們發現:Fnorm = 1 +(?F /?TST)的溫差。由于熒光強度的線性和熱泳枯竭,Fnorm(A)未結合的分子歸熒光和約束復雜的Fnorm(AT)線性疊加。 表示x 的綁定到目標分子的一小部分,在目標T 滴定的熒光信號不斷變化的計算公式如下:Fnorm=(1-x) Fnorm(A)+x Fnorm(AT)。

定量綁定參數獲得通過的約束力基板的連續稀釋。通過繪制F 規范對系列稀釋的不同濃度的對數,獲得一個S 形的結合曲線。這種結合曲線,可以直接安裝質量作用定律的非線性解與解離常數K e,作為結果。微量熱泳(MST)是一種分析生物分子的技術。微尺度熱泳是粒子在微觀的溫度梯度中的定向運動。生物分子結構/構象的變化引起的水化層的變化導致的

實驗流程:

很簡單的實驗方法,避免了昂貴的樣品消耗和繁瑣的制備過程。

結合毛細管使用,大大降低其他的標準的分子相互作用的技術所需的實驗成本,并且可以測量天然狀態環境中的生物分子間的相互作用。

熒光分子的濃度的保持不變而結合分子的濃度梯度增加。一個4 ul 的樣品量被填充在MST 毛細血管,然后使用制造一個局部溫度梯度。由于標記分子在玻璃毛細管中的運動導致的區域熒光強度變化就會被觀測到。既可用標簽/螢光蛋白來發光(NT.115 系統),也可以用色氨酸自發熒光來檢測(NT.LabelFree 系統)。

熒光分子或顆粒最初是自由均勻分布的。在紅外激光照射下,分子收到熱泳動的作用力,而移出加熱區域,最后分子在熱泳動作用力和質量擴散作用力下達到平衡,形成穩定態。在關閉激光后,分子擴散重建均勻分布狀態。下圖顯示

了該過程。


主要特點:

NanoTemper 獨特的MST 技術,可應用于:

☆ 直接在生物溶液環境中測量任何(生物)分子間親和力(KD, 解離常數)

☆ 研究血清、細胞裂解液或其它生物溶液對生物分子的作用,并且能夠分離出真正的結合過

☆ 直接在細胞膜上研究膜結合蛋白

☆ 研究溶液中酶活性、復合物形成、定向組裝過程的多組分反應或者生化成分

☆ 使用熒光標記競爭物以無標記的方式獲得更大的篩選項目 (“競爭性MST” )

☆ 一個靶標上不同結合位點的區分

☆ 研究酶動力學(vmax, kcat)

☆ 研究化學計量學并確定生物分子結合位點的數目

☆ 研究結合能量學ΔG (自由能 ), ΔH (焓) and ΔS (熵)

☆ 直接測量或是在競爭性實驗中研究抑制物親和力Ki

☆ 這個方向是MST 最常用的應用,一個結合物濃度固定,另一個梯度變化…不同于直接相互作用,這寫實驗中

的熒光信號是被競爭物擠下來的分子發出的,用于研究競爭性結合物的結合能力…該研究使用與確定靶分子上的配體結

合位點…該研究用于測定反應中的熱力學參數,包括焓和熵…



蛋白與蛋白之間的作用

蛋白- 蛋白相互作用的熱泳動分析

相互作用分別在三種條件下測量:在純化系統中,使用共價標記的熒光素(A);在緩沖液中使用熒光融合蛋白(B);在細胞裂解液中使用熒光融合蛋白(C)。

Material was kindly provided by Prof. Gideon Schreiber, Weizmann Institute, Israel


Jerabek-Willemsen, M., André, T., Wanner, R., Roth, H. M., Duhr, S., Baaske, P., and Breitsprecher, D. (2014)

MicroScale Thermophoresis:Interaction analysis and beyond.Journal of Molecular Structure



pM 親和力相互作用

不同實驗體系下,使用Monolith NT.115Pico 測量pM 級別的親和力實驗

DNA - DNA 相互作用 (左):用MST 測量單鏈DNA 與Cy5 標記互補鏈的相互作用,該單鏈DNA 包含16 個堿基。對MST 信號變化做曲線擬合,獲得的Kd 值為167 ± 8 pM。

蛋白- DNA 相互作用(中):用MST 分析單鏈結合蛋白(EcoSSB) 與Cy5 標記的低聚核苷酸(dT)70 的相互作用,其中EcoSSB 做梯度稀釋,Cy5 標記的DNA 濃度保持20 pM不變。對MST信號變化做曲線擬合,獲得的Kd值為1 ± 0.1pM。

蛋白- 蛋白相互作用(右):實驗中,NT647 標記的Interleukin-1 受體的可溶性片段保持濃度不變,Anakinra 做梯度稀釋。對MST 信號變化做曲線擬合,獲得的Kd值為620 ± 61 pM。

Material was kindly provided by Dr. Ute Curth, Medial University Hanover, and Dr. Ahmed Besheer,

Novartis, Basel


Jerabek-Willemsen, M., André, T., Wanner, R., Roth, H. M., Duhr, S., Baaske, P., and Breitsprecher, D.

(2014)MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond. Journal of Molecular Structure


視屏一:PD-1/PD-L1 binding studies

?using?MicroScale?Thermophoresis(MST)



視屏二:Protein purification-free method of binding affinity determination by MicroScale?Thermophoresis(MST)



視屏三:understanding the role of assembly factors in ribosome biogenesis




全球頂尖的生物醫藥用戶、高效、科研代表推薦:


客戶代表一:

The impressive advantages of MST, namely the low sample consumption,the broad application range, and swift assay development make it a uniquebiophysical method…In some cases, LabelFree MST allowed us to perform assayswith otherwise “very ill” behaved proteins which were not amenable to any otherbiophysical technique. Generally, we find very good consistency betweenquantitative MST measurements and results stemming from other biophysicalmethods.


客戶代表二:

We use this innovative technology to characterize advanced compounds,but also to confirm screening hits and to prioritize between chemical leadclasses. We use the Monolith NT.115 from NanoTemper Technologies to determinebinding affinities and expand its application range to thermodynamic characterizations…Weobserve a very good agreement of MST to other biophysical methods like surfaceplasmon resonance, X-ray structural information and molecular modeling.


客戶代表三:

MST has proved to be particularly useful to look at molecular interaction involving proteins that are difficult to express or purify. MST requires a relatively short time to setup new assays and is a powerfultechnique for buffer optimisation. Using the NT.115 MST instrument we have successfully measured small molecule-protein and protein-protein interactionsin complex media. Finally, LabelFree MST is one of the few true label-free/immobilisation-free instruments capable of measuring molecularinteractions.


客戶代表四:

This is the first ?MST instrument we’ve purchased, and we have a lot of confidence in the technique. [In fact], we’re the first people in the CRO world to invest in[NanoTemper’s] capabilities.


?客戶代表五:

MicroScale Thermophoresis (MST) is a quick and easy-to-use biophysical method offering quantitative information on biomolecular interactions in solution. Much of what immediately drew us to the method was immobilization-free approach, fast setup,low sample consumption and maintenance-free instrument – things we appreciate every day using this technology. We have been successfully using Monolith NT.115 to measure small molecule-protein binding affinities from the day one.We find the method a good alternative to our standard enzymatic assays and invaluable approach to proteins without enzymatic activity. We are appreciative of all MST instrument readouts, which allow us not only for Kd determination ?but also to control the sample aggregation and learn more about protein-ligand binding mechanism. We consider the MST a highly valuable method and recommend it to anyone seeking very sensitive solution-based binding assay.


?客戶代表六:

Crelux routinelyuses MST as an orthogonal assay for high content hit characterization. Fastassays set-up and straightforward characterization of compound affinity insolution enable us to concentrate on the most promising hits forco-crystallization with their targets and significantly speed up the drugdiscovery process.


?客戶代表七:

We use NanoTemper Technologies’ Microscale Thermophoresis to characterize the affinity of our compounds to their targets.Using this technology we obtained very convincing data that were in agreement with results obtained using other technologies like Surface Plasmon Resonance(SPR). We appreciated the relatively short time for the time to establish theassay compared to alternative methods to measure protein affinities as well asthe comparatively low amounts of protein consumption. We conclude that this new technology gives rise to reliable quantitative affinity data.


客戶代表八:More



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